注射用苯磺顺阿曲库铵有关物质的 LC-MS 初步鉴定分析

摘 要

采用高效液相色谱-高分辨质谱联用技术对注射用苯磺顺阿曲库铵中有关物质进行初步结构鉴定。采用SEPAX GP-C18(250mmx4.6mm，5um)色谱柱，水-乙腈-甲醇_甲酸(650:175:175:10，1.010L中含有甲酸铵1.3g)的流动相进行等度洗脱。对注射用苯磺顺阿曲库铵有关物质进行分离，采用LC/TOF-MS测定各个有关物质的准确质量,电喷雾离子化LC-MS/MS进行结构解析。共检测出11个有关物质，其中7个的含量在0.1%以上，并初步鉴定了它们的结构,其中5个有关物质在已有药典标准中未有明确规定。

关键词  苯磺顺阿曲库铵 有关物质  LC/TOF-MS LC-MS/MS

注射用苯磺顺阿曲库铵的主要成分为苯磺顺阿曲库铵,化学名为(1R,1'R,2R,2'R)-2,2'-(3,11-二氧代4,10-二氧十三烷撑)二(1,2,3,4-四氢-6,7-二甲氧-2-甲基-1-藜芦基异喹啉)二苯磺酸盐。阿曲库铵有4个手性原子,并且分子结构对称,因此有10 种立体异构体。顺式阿曲库铵是阿曲库铵的顺式异构体,它与阿曲库铵具有相似的代谢方式和肌松效应,其效能强于阿曲库铵,是近年来临床麻醉中最常用的中时效非去极化肌松药之一。美国药典、英国药典和欧洲药典均收录了苯磺酸阿曲库铵,规定采用含有非挥发性缓冲盐的流动相梯度洗脱对其有关物质进行检查,并提供了可能存在的部分有关物质的化学结构式及名称，但是苯磺顺阿曲库铵未见收载。《中华人民共和国药典》二部(2020年版)收载了苯磺顺阿曲库铵及注射用苯磺顺阿曲库铵,对有关物质总量和部分单个有关物质含量限度进行控制,但是缺乏杂质对照品和典型色谱行为参照。根据人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)要求,对药物中含量大于0.1%的杂质要进行定性研究。因此，研究注射用苯磺顺阿曲库铵有关物质并进行结构分析或归属,对保障其临床使用的安全性和有效性至关重要。

1 材料

1.1 药品与试剂

注射用苯磺顺阿曲库铵[批号:A11220601,上药东英(江苏)药业有限公司];乙腈、甲醇(色谱纯,美国 Merck公司):其余试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

Agilent1260 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);1260Infinity液相色谱-6224飞行时间质谱仪，CDS Analysis 2.2数据处理系统(美国安捷伦公司);TSO Quantum UltraAM型LC-MS/MS 联用仪，Xcalibur 1.2 数据处理系统(美国 Thermo Finnigan 公司);Milli-Q 超纯水机(美国密里博公司)。

2 方 法

2.1 色谱/质谱条件

2.1.1 色谱条件 SEPAX GP-C18(250 mm x4.6mm,5 μm)色谱柱,水-乙腈-甲醇-甲酸(650:175:175:10,1.010 L中含1.3 g甲酸铵)流动相等度洗脱;柱温:35 ℃;流速:1.0 mL/min;进样量:20 μL;检测波长:280 nm。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子化方法正离子检测。TOF-MS 测定的喷雾电压4kV,雾化气压力 2.76x105 Pa，流量 10 L/min,温度350℃，碎片电压 200 v.参比离子 m/z 121.0508和922.0098,质量扫描范围 m/z 100 ~1200。MS/MS测定的喷雾电压5kv，雾化气压力3.10x105Pa,辅助气压力1.38x105Pa,毛细管温度350 ℃,二级质谱碰撞气氩气压力 0.17 Pa,碰撞能量 25 eV。柱后分流，0.2 mL/min 进入质谱检测,同时用 0.2 mL/min 乙腈 ESI 鞘液辅助质谱离子化。

2.2 供试品溶液的制备

取注射用苯磺顺阿曲库铵适量,加流动相溶解并稀释成质量浓度约为 0.5 mg/mL 的溶液,滤过,取续滤液作为供试品溶液。

3 结果和讨论

3.1 有关物质检查图谱与数据

将供试品溶液按“2.1.1”和“2.1.2”项下色谱与质谱条件,利用 LC/TOF-MS 和 LC-MS/MS 分别采用全扫描质谱和子离子二级质谱对样品进行检测。获得注射用苯磺顺阿曲库铵的 DAD 图(图略)、总离子流图及二级质谱图。根据HPLC-UV测得各有关物质保留时间从小到大顺次编号,显示 11 个主要有关物质峰,其中7个(峰1、2、4、6、8、10和11)的含量大于0.1%。

3.2 有关物质的实验式鉴定

根据本品结构特征,对 LC/ESI-TOF-MS 测得各有关物质正离子的准确质量,通过 Mass Hunter软件进行有关物质的实验式鉴定(设置C、H、O、N组成限度分别为60、120、30 和5,质量偏差限度为3)。结果表明,注射用苯磺顺阿曲库铵中的主要有关物质为其中间体、结构单元以及它们的同分异构体。

3.3 有关物质的质谱解析与结构推定

注射用苯磺顺阿曲库铵及其部分有关物质结构中均含季铵离子基团,电喷雾离子化时可形成[M]2+或[M]+离子;另有部分有关物质结构中含有叔胺基团,则在电喷雾离子化时可形成[M+H]²或[M+H]+离子。根据所测得各有关物质的母离子及其二级质谱碎片离子进行解析,并参照欧洲药典关于苯磺酸阿曲库铵的系统适用性试验及可能的有关物质结构,可对本品中各有关物质的结构进行初步鉴定。

顺阿曲库铵与有关物质峰8:ESI-MS 测得顺阿曲库铵C53H72N2O122+母离子[M]2+的m/z为464，其二级质谱中主要产生的碎片离子为m/z370、358、327、307、244、189、165 和151。母离子中的1个四氢吡啶环的逆狄-阿反应开环裂解分别形成含有2个季铵基团的双电荷碎片离子 m/z307 和含有1个季铵基团的单电荷碎片离子 m/z244。母离子中四氢吡啶环的开环裂解还形成不含氮原子的特征碎片离子 m/z327,进一步断裂形成 m/z 189、165 的特征单电荷碎片离子。结构中与四氢异喹啉N相连支链的价键断裂，则形成m/z分别为370 和358 的具有藜芦基异喹啉母核结构单元特征的单电荷含氮碎片离子。m/z 358 进一步断裂形成 m/z151 的特征单电荷碎片离子。参考欧洲药典苯磺酸阿曲库铵标准中所列出的可能有关物质结构,确证其为阿曲库铵的顺-反异构体。有关物质峰1:LC/TOF-MS 确定其离子组成为C21H28NO4+，碎片离子 m/z370、327、189、165和151 与顺阿曲库铵二级质谱中的特征碎片离子相同,说明也具有藜芦基异喹啉的母核,推测其可能为顺阿曲库铵结构中酯键断裂形成的单季铵离子产物,m/z 116 为其特征碎片离子,为结构中四氢吡啶环的逆狄-阿反应开环裂解形成。并参考欧洲药典,确证有关物质峰1为3-[1-(3,4-二甲氧基苄基)-6,7-二甲氧基-2-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉]丙酸盐。有关物质峰 2:LC/TOF-MS 确定其离子组成为C21H28NO4+,比顺阿曲库铵的相对分子质量少 572，推断由顺阿曲库铵主要结构单元脱落形成。m/z206为其特征碎片离子,为结构中四氢异喹啉环上与碳相连的取代基断裂形成。并参考欧洲药典,确证有关物质峰2为1-(3,4-二甲氧基苄基)-6,7-二甲氧基-2-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉。有关物质峰3和 4:LC/TOF-MS 确定两者离子组成均为C25H34NO6+。比有关物质峰1的相对分子质量多14。两者碎片离子相同,推测有关物质峰3和4在结构上为有关物质峰1的甲酯化物。m/z130为其特征碎片离子,为结构中四氢吡啶环的逆狄-阿反应开环裂解形成。综上,有关物质峰3和4为3-[1-(3,4-二甲氧基苄基)-6,7-二甲氧基-2-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉]甲基丙酸酯的一对顺反异构体,根据欧洲药典，推断有关物质峰3为反式异构体,有关物质峰4为顺式异构体。有关物质峰6为顺式异构体。有关物质峰7:LC/TOF-MS确定其离子组成为C53H72N2O13+,比顺阿曲库铵的相对分子质量多16,推测其为顺阿曲库铵结构中苯环羟基化的产物。特征碎片离子 m/z 343 为母离子中含酚羟基的1个四氢吡啶环的逆狄-阿反应开环裂解形成,m/z 315为结构中含酚羟基的四氢吡啶环开环断裂形成。

4 结论

建立的高效液相色谱-高分辨质谱法通过鞘液乙腈来提高电喷雾检测的灵敏度，可以检测注射用苯磺顺阿曲库铵中11种可能的有关物质。通过测定的每个杂质峰的质谱和分析，结合《欧洲药典》苯磺酸阿曲库铵标准中列出的可能的相关物质的结构比较，直接鉴定或间接衍生出所有检测到的相关物质结构，其中峰3,4和峰7的相应相关物质未包含在现有药典标准中。实验结果为注射用苯磺顺阿曲库铵的质量控制和工艺优化提供了参考。

参考文献

[1]Blazewicz A,Fijalek Z, Warowna-Grzeskiewicz M.et al. Determi-nation of atracurium.cisatracurium and mivacurium with theirimpurities in phanmaceutical preparations by liquid chromatogra-phy with charged aerosol detection [J]. J Chromatogr A, 2010,1 217(8):1 266 -1 272.

[2]LongY,LiZM,Yi LQ. Progress in the study of the new musclerelaxants-rapacuronium.rocumnium and cisatracuriumj

Henan Med Res(河南医学研究)，2006.15(3):267-271.