基于GEO数据库筛选介导原发性膀胱癌病理特征的Hub基因及其调控网络

【摘要】目的 基于高通量基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库，利用生物信息学研究方法筛选介导原发性膀胱癌病理特征的hub基因及其调控网络，为指导临床诊断和治疗提供新的理论参考。方法 GSE13507数据集来自GEO数据库，利用R软件筛选DEGs。利用WGCNA分析探索基因模块与表型之间的关系。二者结果取交集，筛选病理分级相关差异基因（grade related Differentially Expressed Genes，grDEGs）。grDEGs导入STRING数据库建立PPI网络，通过Cytoscape实现结果可视化，利用MCODE插件展示核心子网络。绘制ROC曲线判断hub基因诊断价值。绘制hub基因的miRNAs-mRNA调控网络。结果 从GSE13507数据集中共获得169个DEGs，与WGCNA关键模块取交集后得到82个grDEGs。MCODE插件鉴定到了1个核心子网络，包括22个Hub基因。基因诊断ROC曲线显示TPX2和CDCA5的AUC分别是0.821和0.823。miRNA-mRNA调控网络显示了TPX2受12个miRNA调控，CDCA5受9个miRNA调控。结论 本研究发现TPX2和CDCA5的诊断效能较高，可作为膀胱癌病理特征的潜在分子标记物，二者可与多个miRNA形成复杂的调控网络介导膀胱癌病理分级。干预关键调控网络，可能对降低肿瘤的恶性程度和改善患者预后有重要意义。

世界卫生组织最新统计数据显示，膀胱癌是仅次于前列腺癌的世界第二大泌尿系肿瘤，每年全球新增加病例数超过400000例，发病率及死亡率仍逐年增高[1]。肿瘤分子标志物是恶性肿瘤在发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或是由机体对肿瘤细胞反应异常产生或者升高的一类化学物质。肿瘤分子标志物可以帮助临床医生判断肿瘤性质，为准确分类、判断预后等提供参考依据[2-4]。目前，尽管膀胱癌早期诊断的分子标志物有很多，包括核基质蛋白22、膀胱肿瘤抗原BTA、ImmunoCyt、纤维蛋白降解产物FB/FDP等，但仍没有可靠的分子标记物用于指导膀胱癌病理分级。

临床上膀胱癌分级有高级别和低级别，二者在恶性程度、治疗方式、治疗效果和预后等方面有所不同。低级别膀胱癌通常分化程度较好、恶性程度较低、预后较好，一般不易复发。高级别膀胱癌通常分化程度较低、恶性程度较高、易转移、预后较差。目前，找到可靠的病理分级分子标记物，一方面可为临床决策提供更准确的参考依据，另一方面可为膀胱癌的基础科学研究提供新的线索和理论参考。

1资料与方法

1.1数据集筛选与获取

以膀胱癌为关键词检索GEO数据库（http://www.ncbi.nlm/nih.gov/geo/），得到人膀胱癌研究数据集GSE13507。

1.2数据整理和差异表达基因（DEGs）筛选

使用R语言软件（4.3.0版本）对表达矩阵数据进行整理。利用limma包进行DEGs分析，LogFC＞1 adj.P.Val＜0.05的DEGs认为是上调基因，LogFC<-1 adj.P.Val＜0.05的DEGs认为是下调基因，并应用ggplot2包制作火山图。

1.3 加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis，WGCNA）

利用R语言软件WGCNA包探索基因模块与表型之间的关系，绘制基因集合中基因之间的调控网络。通过Pearson相关性分析计算模块和临床性状之间的相关系数r，并利用pheatmap包生成基因模块-临床特性热图。

1.4grDEGs的筛选

利用Venn在线网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）将WGCNA关键模块基因集与DEGs取交集得到grDEGs。

1.5PPI网络的构建和枢纽基因（Hub gene）的筛选

将grDEGs上传到STRING数据库（https：//string-db.org/），筛选评分>0.7的高置信度互作节点数据，隐藏无关联的基因。将STRING数据库结果导入Cytoscape软件（3.8.1版本，https：//www.cytoscape.org/），并通过MCODE插件展示高分值的模块。

1.6Hub基因诊断受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线的构建

利用GraphPad Prism 6.0.1软件绘制Hub基因诊断ROC曲线，并计算曲线下面积（area under curve，AUC）。

1.7 Hub基因调控网络的构建

利用miRecords， miRTarBase和TarBase数据库预测2个Hub基因miRNAs，三个数据库预测结果取交集。将得到的mRNA和miRAN数据导入Cytoscape软件构建miRNA-mRNA调控网络。

2结果

2.1DEGs的筛选

数据表达矩阵预处理后，根据adj.P.Val＜0.05且|log FC|＞1，从GSE13507数据集中筛选得到93个上调基因和76个下调基因，见图1A。

图1  A：DEGs火山图，红色点为下调基因，蓝色点为上调基因；

B：动态剪切树法确定最佳软阈值；C：层次聚类树；D：基因模块与病理分级相关性热图，红色为正相关，蓝色为负相关，颜色越深相关性越强

2.2WGCNA网络构建和显著基因模块的识别

对GSE13507数据集中165个样本表达谱中绝对中位差前25%的基因构建了共表达模块。软阈值设置为8时共表达网络接近无尺度网络。采用动态剪切树算法，获得12个基因共表达模块。接下来，我们分析了不同模块与原发性膀胱癌病理分级的相关性，热图结果显示brown模块与高级别原发性膀胱癌呈正相关，且相关性最强（r=0.56，P=4e-15），见表1D。因此，我们选择brown模块基因集合进行后续分析。

2.4 grDEGs的筛选

我们将brown模块的606个基因和GSE13507数据集得到的169个DEGs导入Venn在线分析网站取交集得到82个grDEGs，并绘制韦恩图，见图2A。

2.5 PPI网络的构建和Hub基因的筛选

将82个grDEGs导入STRING分析网站，并利用Cytoscape软件将结果进行可视化。利用MCODE插件鉴定到了包括1个包含22个Hub基因的核心子网络。

2.6 Hub基因的诊断价值

利用GraphPad Prism 6.0.1软件对22个Hub基因进行ROC曲线分析并计算AUC。AUC越接近于1，被认为诊断效果越好，在0.7-0.9之间，被认为具备一定的准确性，在0.5-0.7之间，被认为具备较低的准确性。ROC曲线分析结果显示TPX2和CDCA5的AUC分别是0.821和0.823，表明TPX2和CDCA5可以作为诊断原发性膀胱癌病理分级的潜在分子标记物，见图2B。

2.7 Hub基因miRNA-mRNA调控网络

miRNA-mRNA调控网络显示CDCA5受9个miRNA调控，TPX2受12miRNA调控（图2C和D），结果提示原发性膀胱癌病理分级有复杂的基因调控网络。

图2 A：WGCNA的brown模块基因集和DEGs的韦恩图； B：TPX2和CDCA5基因诊断ROC曲线；C：CDCA5的miRNA-mRNA调控网络；D：TPX2的miRNA-mRNA调控网络，橘色代表mRNA，绿色代表miRNA。

3讨论

肿瘤发生与细胞周期的调控紊乱密切相关。针对细胞周期的干预治疗一直是肿瘤领域研究的热点[5]。细胞分裂周期相关蛋白5（Cell division cycle related protein 5，CDCA5），编码CDCA5蛋白，主要调节染色单体粘合和分离[6]。有研究证实，CDCA5在胃癌肺癌中均存在异常表达[7-8]。敲低人膀胱癌细胞株T24和5637细胞中CDCA5的表达，可降低肿瘤细胞增殖并诱导凋亡[9]。本研究结果显示，CDCA5在原发性膀胱癌高级别和低级别肿瘤样本中差异表达，可能与CDCA5参与了细胞周期时相异常调控有关。

 爪蟾激肽样蛋白2的靶向蛋白（targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2，TPX2）是一种微管相关蛋白，通过介导纺锤体组装和动力过程参与细胞有丝分裂或减数分裂。TPX2被发现在胰腺癌和骨肉瘤等多种肿瘤内异常表达[10-11]。另有研究发现，TPX2可作为神经母细胞瘤和胰腺癌预后的分子标志[12]。本研究发现，TPX2在原发性膀胱癌高级别和低级别肿瘤样本中差异表达，可能与TPX2参与膀胱癌细胞的异常有丝分裂过程，导致细胞非整倍体增加有关。综上所述，本研究发现细胞周期调控异常是导致原发性膀胱癌病理分级差异的一个重要原因，针对细胞周期的肿瘤干预措施是治疗膀胱癌的关键。随着TPX2和CDCA5在细胞周期调控紊乱中的深入研究，TPX2和CDCA5可能成为治疗膀胱癌的新靶点。

参考文献

1 宋亚辉. siRNA抑制LivIn基因的表达对人膀胱癌EJ细胞生长及化疗敏感性的影响[D]．桂林医学院硕士论文，2015.

2 Vladimir Jurisic;Sandra Radenkovic;Gordana Konjevic.The Actual Role of LDH as Tumor Marker, Biochemical and Clinical Aspects.[J].Advances in experimental medicine and biology.2015：115-124.

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4 Evi S Lianidou;Athina Markou;Areti Strati.The Role of CTCs as Tumor Biomarkers.[J].Advances in experimental medicine and biology.2015：341-367.

5 Otto T, Sicinski P. Cell cycle proteins as promising targets in cancer therapy. Nature  reviews Cancer. 2017;17(2):93-115.

6 Zhang N, Pati D. Sororin is a master regulator of sister chromatid cohesion and  separation. Cell cycle. 2012;11(11):2073-83.

7 Chang IW, Lin VC, He HL, Hsu CT, Li CC, Wu WJ, et al. CDCA5 overexpression is an indicator of poor prognosis in patients with urothelial carcinomas of the upper urinary tract and urinary bladder. American journal of translational research. 2015;7(4):710-22. 25.

8 Tokuzen N, Nakashiro K, Tanaka H, Iwamoto K, Hamakawa H. Therapeutic potential of targeting cell division cycle associated 5 for oral squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(3):2343-53. 26.

9 Fu, G.;Xu, Z.;Chen, X.;Pan, H.;Wang, Y.;Jin, B..CDCA5 functions as a tumor promoter in bladder cancer by dysregulating mitochondria-mediated apoptosis, cell cycle regulation and PI3k/AKT/mTOR pathway activation(Article)[J].Journal of Cancer.2020,Vol.11(No.9)：2408-2420.

10 S.L. Warner, B.J. Stephens, S. Nwokenkwo, G. Hostetter, A. Sugeng, M. Hidalgo, J.M.  Trent, H. Han, D.D. Von Hoff, Validation of TPX2 as a potential therapeutic target in  pancreatic cancer cells, Clin Cancer Res, 15 (2009) 6519-6528.

11 毛敏.TPX2调控骨肉瘤增殖、转移的作用和机制研究[D]．上海交通大学博士论文，2019.

12 苏靓誉,张振西,杜文静.TPX2的表达对胰腺癌预后的影响[J].基础医学与临床,2023,(第6期):875-881.

基金项目：儋州市科技和工业信息发展局项目

项目编号：儋科工信[2024]73号